È indetta una selezione, mediante procedura comparativa, per il conferimento di n.1 Borsa di Ricerca di seguito specificata.
Titolo del Progetto di ricerca: Sensori fluorescenti codificati geneticamente per il monitoraggio di ossido nitrico intracellulare
Tematiche del Progetto di ricerca: Lo scopo dell'attività di ricerca è la caratterizzazione di due sensori fluorescenti codificati genetica-mente per la rivelazione di ossido nitrico intracellulare mediante spettroscopia e microscopia di fluorescenza. Il primo costrutto chimerico è un sensore raziometrico che comprende la proteina fluorescente blu mTagBFP2 fusa, mediante un linker, ad una proteina fluorescente rossa, mScarlet3. La prima (mTagBFP2) mostra proprietà di emissione di fluorescenza dipendenti dall'NO, con un quenching dell'emissione dovuto ad un fenomeno di FRET dal cromoforo di mTagBFP2 verso i cro-mofori delle cisteine, formati a seguito della nitrosilazione in presenza di NO. La fluorescenza della seconda (mScarlet3) risulta invece insensibile all'NO essendo priva di residui di cisteina. Il costrutto così ottenuto mostra quindi un funzionamento raziometrico, in cui l'emissione da parte di mScarlet3 viene utilizzata come normalizzazione del segnale. Utilizzando spettroscopie di assorbimento e di fluorescenza, anche risolte nel tempo, verranno dapprima caratterizzate le risposte all'ossido nitrico delle proprietà di emissione di fluorescenza delle proteine purificate. Verranno quindi svolti esperi-menti su cellule di mammifero (HeLa) per verificarne il funzionamento in cellule di coltura. Il se-condo costrutto chimerico comprende invece un dominio fluorescente (il mutante di mTagBFP2 privo di residui di cisteina) ed un secondo dominio non fluorescente, collegato mediante un linker
flessibile, ad una nitroforina. La nitrosazione del Fe(III) del gruppo eme della nitroforina porta ad un cambiamento spettrale che modula il FRET dalla mTagBFP2 verso il gruppo eme. Anche per questo costrutto, utilizzando spettroscopie di assorbimento e di fluorescenza, anche risolte nel tempo, ver-ranno dapprima caratterizzate le risposte all'ossido nitrico delle proprietà di emissione di fluore-scenza delle proteine purificate. Verranno successivamente svolti esperimenti su cellule di mammi-fero (HeLa) per verificarne il funzionamento in cellule di coltura.
Responsabile scientifico del Progetto: Prof. Cristiano VIAPPIANI, E-mail: cristiano.viappiani@unipr.it
